Department of Biotechnology, Center for Chemistry and Chemical Engineering, Lund University, P.O. Box 124,Lund S-221 00, Sweden (_author for correspondence)

Received 14 August 1997; accepted 14 May 1998

Key words: metal chelate, affinity precipitation, poly(N-isopropylacrylamide-co-vinylimidazole), thermo precipitation,cloud-point, protein purification, protein inhibitors

Abstract

Metal chelate affinity precipitation of proteins, a method combining metal–protein interaction and affinity precipitation is being discussed as a selective separation process for proteins. The technique utilizes a flexible soluble–insoluble thermo-responsive polymer with a covalently linked ligand loaded with metal ions. The affinity binding of the target protein varies with different metal ions. Copolymers of N-isopropylacrylamide with 1-vinylimidazole loaded with Cu(II) ions are designed as a potential carriers for affinity purification and proved to be successful for purification of protein inhibitors from a variety of cereals.

金属螯合亲和沉淀法:一种新的蛋白质纯化的方法

A. Kumar, I.Yu. Galaev & B. Mattiasson

Department of Biotechnology, Center for Chemistry and Chemical Engineering, Lund University, P.O. Box 124,Lund S-221 00, Sweden (author for correspondence)

Received 14 August 1997; accepted 14 May 1998

关键词：金属螯合，亲和沉淀，聚（异丙基丙烯酰胺-乙烯基咪唑共聚物），热沉淀法，浊点，蛋白质纯化，蛋白质抑制作用

摘要
金属螯合亲和沉淀的蛋白质，正在讨论一种方法，结合的金属-蛋白质相互作用及亲和沉淀，、，作为一种选择性的分离蛋白质。该技术采用了一种灵活的可溶不溶性温度感应型聚合物具有共价键相连的金属离子。亲和有约束力的对象因不同的蛋白质具有不同的对应金属离子。共聚物的异丙基丙烯酰胺与1 -乙烯基咪唑共聚物，载有二价铜离子的目的是作为亲和纯化的载体，并证明成功的从各种粮食作物中分离纯化蛋白质抑制剂。

介绍

发展高效、快速的分离纯化方法，在生物分离一直是一个具有挑战性的任务。与飞速进步的基因工程技术的发展，它已不可能得到任何想要的蛋白产物，但回收这些产品，仍然构成一个重大问题。亲和技术为蛋白质纯化提供手段，从复杂的混合物净化出一个特定蛋白质。这个概念的使用金属螯合物在亲和技术是一个突破，介绍（Porath et al.1975）。因此，固定化金属螯合亲和（IMA）技术，例如，IMA的色谱法，现正得到广泛应用，在蛋白质纯化，特别是在处理与重组蛋白方面面（Arnold, 1991; Sulkowski, 1985）。这提供了一些重要的优势超过那些“生长素”亲和技术蛋白质纯化关于对配合机体的稳定性，蛋白质装载和复性（Arnold, 1991）。

该技术是普遍的基础上，有选择性的互相作用干扰金属离子铜（二价） ，锌（二价） ，镍（二价）或钴 （二价），于蛋白质这是固定于固体支持和供电子集团。氨基酸组氨酸，半胱氨酸，色氨酸和精氨酸，有强大的电子供应团体在其侧链，暴露残基的存在是一个重要因素，影响固定化金属螯合物的结合性（hemdan和porath，1985） 。这个概念也适用于技术在不同的形式中。像IMA沉淀在水溶液中的两相聚合物体系（Birkenmeier et al., 1991;Franco et al., 1997; Otto and Birkenmeier, 1993）或金属螯合亲和沉淀（galaev和mattiasson1993年; galaev ，1997）。由于应用的是大型的进程，这使得它更可行且能符合低成本高效益。双水相用于分离及分馏蛋白质，细胞与细胞粒子，是一个历史悠久的技术，而且是基于水溶性高分子聚合物的能力之上，如葡萄糖和聚乙二醇，形成两相体系(Albertsson,1986) 。有选择地应用这种方法，利用了蛋白质的相互作用与配体的亲和力，这是共价附在其中一相形成聚合物，从而提取一种特定的蛋白质转化的成另一想，且大部分的蛋白质仍留在这相中。该IMA的概念是通过嫁接一个金属螯合剂延伸至另外一个相分配法，含亚基的双乙酸变成聚丙二醇，及配体能够螯合过渡金属离子，对靶蛋白具有亲和力(Birkenmeier et al., 1991) 。亲和沉淀的方法主要有两个途径，在文献已被描述，(Gupta and Mattiasson, 1994),既双功能配体的正相和反相沉淀。先前有少数企图利用金属亲和层析的概念，在亲和沉淀方法用两种不同的方法解释。于最佳浓度加上一个双配体处产生了一个交联网络给靶蛋白提供两个或两个以上的金属结合位点。横向交联的蛋白双配体网络沉淀是来至于最后的溶解。第一次应用由Van Dam等所报道.1989时在实验室方法中用二价铜离子金属螯合的方法来大量沉淀人体血红蛋白和抹香鲸血红蛋白。这项研究仅描述沉淀的纯蛋白，并且不出示对蛋白质洗脱和复性的结果。在另一项研究中，Lilius et al. (1991)，描述了通过金属亲和沉淀纯化的基因工程半乳糖醛脱氢酶与聚组氨酸尾部。该组氨酸发挥亲和力尾巴和这种酶可以沉淀时，双锌配合乙二醇-二- β-胺醚,而EGTA锌，增加了蛋白质的溶解度。该酶被纯化了11倍，90 ％的回收和最终产量的80 ％ 。但是，一般来说，应用的的亲和沉淀配体已相当有限(Gupta et al.,1996)。浓度依赖性和终端的集合团聚体形成进一步其使用复杂化（Flygare et al., 1983)） 。异双功能体形式的亲和沉淀是一种较为普遍的做法，其中亲和配体的共价键，再加上可溶性不溶性聚合物。配体具有选择性约束了目标蛋白从天然物质中的提取。蛋白质聚合体的混合物因环境中一个因素的改变而沉淀出来（ ph值，温度和离子强度）。最后，被分离的蛋白质从聚合物中分离出来，而且被修复和重复利用另一种循环中(Gupta and Mattiasson,1994） 。在金属离子螯合亲和沉淀中，金属配合物是共价键与聚合物联系的与目标蛋白质由金属离子与聚合物绑定。第一次应用是来自于纯化猪肌肉中乳酸脱氢酶是通过用铜(II)载体热敏聚合物的来的，聚乙烯基己内酰胺含开IDA的配体(Galaev and Mattiasson, 1993） 。研究结果显示，有些因为受酶活性的失活的限制，在这个实验中IDA配体的失败应用就可以解释清楚了。聚合物沉淀具有疏水性，对乳酸脱氢酶是不利的条件。这种酶脱从金属离子聚合物中脱离，沉淀和没有螯合的铜离子引起失活的乳酸脱氢酶的浮起。通过设计热敏金属螯合共聚物和学习他们蛋白质纯化技术的应用，我们在这些技术上也取得了很多进步。

合成热敏金属螯合共聚物

热敏聚合物构成一组的可逆性可溶性不溶性聚合物。其中，聚异丙基丙烯酰胺 ，聚乙烯基甲基醚和聚N-乙烯基己内酰胺已被广泛的研究和应用到各种研究里面(Galaev et al., 1997)。固定和纯化生物分子利用这些聚合物曾经被报道过(Chen and Hoffman, 1994; Nguyen and Luong, 1989） 。在我们的实验室，共聚物N-异丙基丙烯酰胺基本应用亲和沉淀的方法。聚N-异丙基丙烯酰胺在水中沉淀的临界温度为32度水且低于这个温度亲水而高于这个温度就是输水了(Schild, 1992)。这个转变出现不是突然的而是被称谓较低临界溶解温度（ lcst ）或白浊点。聚N-异丙基丙烯酰胺没有反应基，直接用做亲和配体的连接，因此，N-异丙基丙烯酰胺共聚物用量很大。传统上， 多配位基的羧基含有配位体像亚氨基二乙酸或氨三乙酸都在金属螯合物和纯化的蛋白方面相当成功（Porath, 1992）。这个想法，我们较早前曾合成亚氨基二乙酸共聚物N-异丙基丙烯酰胺由自由基聚合（Kumar et al., 1998a）。亚氨基二乙酸-基元引入（ 高电荷量，中性条件）到聚合物成绩急剧下降，沉淀效率温度随N-异丙基丙烯酰胺聚物习性而变。带负电荷亚氨基二乙酸成分，使更多的亲水性大分子，阻碍聚集和沉淀的聚合物。带负电荷开发协会成分，使更多的大分子亲水性，阻碍聚集和沉淀的聚合物。据指出，当共聚物装有金属离子，它压制了很多电荷，该共聚物可以沉淀在温度稍微高于那些聚N-异丙基丙烯酰胺 （Kumar et al., 1998a; Mattiasson et al., 1998） 。该热沉淀这种聚合物大在35 – 40度时允许它仅应用在净化耐热蛋白质。在这个方向上的突破，我们找了一个新的配体，咪唑（Galaev et al., 1997）。乙烯基咪唑共聚物（VI）与N-异丙基丙烯酰胺，在水溶液中poly–VI–NIPAM游离自由基引发聚合反应。始于5，10，17和33mol ％与乙烯基咪唑共聚物，在反应混合物，5，10，15.6和26.8 mol ％乙烯基咪唑中有共聚N-异丙基丙烯酰胺。分别得出核磁共振谱的范围（Mattiasson et al., 1998）。可以很清楚的观察到N-异丙基丙烯酰胺的峰从咪唑中分离出来（图1 ） 。

乙烯基咪唑- N-异丙基丙烯酰胺聚合物的沉淀性质

把相关的亲水咪唑修饰成氮异丙基丙烯酰胺，阻碍了疏水相互作用，并导致增加了沉淀温度或浊点（图2 ） 。随着乙烯基咪唑共聚物共聚物含量的增加，浊点也有所增加（ 26.8 mol ％VI，浊点在48°C 左右），ph值为8.0沉淀析出 。然而，在ph值低于4和6 ，咪唑基团是质子化了，而且形成了愈来愈多的亲水性聚合物分子。加热至70°c是没有沉淀生成了。另一方面，关于聚N-异丙基丙烯酰胺在35°c是有沉淀析出，并有特定ph值（Galaev et al., 1997; Kumar et al., 1998a) 。当载满金属离子是，共聚物的沉淀效率仍在下降直到ph为8.0时。

 

图2 。

各个符号所表示的物质，和摩尔量。浊点是随温度而0.1 ％（w/v）聚合物溶液显示，有一半的最大吸收在470 nm左右。

图3.在氯化钠存在的情况下poly-VI–NIPAM的热沉淀载满了不同的金属离子的比较。锌0.2m和氯化钠0.4m;铜0.5M和0.4m氯化钠;镍0.2M和 0 .4m氯化钠;钴0.2M和0 .4m氯化钠。

加热至70°c时，聚合物仍无法取得任何的沉淀。这是因为金属离子以吸引更多正电荷移向共聚物，并使它具有亲水。在这方面的作用不同金属离子没有现实出不通的特性。实现了完全沉淀这种共聚物，其中应包含条件，促进疏水相互作用和减少相互排斥作用所造成的类似费用。增加离子强度，从而减少电荷斥力加入氯化钠便利沉淀这些金属方向共聚物

（图3 ） 。锌、铜离子的共聚物进行了高效率的沉淀和定量沉淀约1 5°c在一个温和的食盐浓度为0.4m氯化钠（图3）。在相同浓度的氯化钠，镍约束共聚物沉淀，在室温（约2 5_c） ，而钴共聚物表明，显着高于降水量的温度约4 2°c。不过，这种共聚物还可以完全沉淀在室温下用稍高食盐浓度为0.8 m氯化钠。有意思的是，注（图2），即沉淀温度或浊点下降为铜（ ii ）满载共聚物随着乙烯基咪唑共聚物含量共聚物。这是可以理解的，因为事实上较高咪唑会形成更多的交联与金属离子，这有利于聚集和最后沉淀的共聚物。

不同金属离子的角色

这些共聚物当载入不同的金属离子，会出现另外的一些物理特征。 所有载入金属离子的共聚物会显示出从溶解状态到沉淀的形式的急剧转变;

然而，用不同的金属离子产生的沉淀物的类型也不同。载入Co (II)的共聚物沉淀物(表1)形成了结实的沉淀物，因此留存了最少的水含量(9.46 ml/g聚合物)。

与锌Zn(II) 捏合一起的共聚物形成松散的沉淀物，因而保留较高的水含量。 Cu (II) -和Ni (II) -捏合一起的共聚物形成了相当一致的沉淀物并且保留了适度水含量。 这样共聚物的物理性质之间的差别能造成在沉淀过程中和蛋白质的还原的整体效果。

图4咪唑金属络合物形成柔性聚- poly-Vi-Nipam共聚物与其蛋白质表面

所有金属离子的相互作用，特别是蛋白质是潜在的组成进行了吸附中心，为ima的方法所有金属离子的在吸附中心会相互影响特别与蛋白质这个潜在的伙伴根据IMA理论. 尤其值得注意在IMAC中 (Porath 1992) 被极度推荐研究中锌(二价)，铜 (二价)，镍 (二价)和钴 (二价)。蛋白质亲合力的增加是因为钴(二价)，镍 (二价)和铜 (二价)离子序列d电子的数量的和锌（二价）减少有关。根据欧文威廉斯定律(Porath和Olin 1983)。我们用来自小麦淀粉酵素的抑制能力评估了NIPAM 共聚物的沉淀和还原能力,当这些共聚物有不同的金属离子载体的时候. 麦子的白蛋白片断包含几个淀粉酵素抑制(Bedetti等， 1974年; Buonocore等，1985年; Donnell和McGeeney 1976)。

他们一般是来源于不同的淀粉酵素，彼此有不同分子量、特异性相互抑制的 (Silano等， 1975)，并且，最重要，使特殊种类的麦子汁浓度的改变 (Bedetti等， 1974

麦子萃取物包含相对地高数目的与IMA相关残渣在目标蛋白质表面上。做一个理想的系统评估潜在的金属离子在这目标蛋白质角色中的结合和还原能力。淀粉酵素抑制结合和还原能力对应不同的金属螯合聚合物在表2中提出了。载体为锌的共聚物被形成的松散沉淀物和导致非特异性坑害一些蛋白质。 大约82%亲和力能与有锌(二价)载体的共聚物的结合，并且用1 (摩尔) 氯化钠洗涤蛋白质聚合物复合体,可以除去17%活动在聚合物胶凝体上松散地结合物和非特异性蛋白。用200毫摩尔咪唑洗涤有结合物的蛋白质，缓冲到PH值7.0，重新获得仅66%结合度的目标蛋白质，选择一些蛋白质紧紧结合或者无特殊结合的。 这里使用的洗涤缓冲方法比通常使用的IMA色谱法那个相对的强(Porath 1992; Vosters，1992)。当以钴(二价)和镍(二价)离子为载体的共聚物时，数量相当少蛋白质抑制了沉淀。 蛋白质与镍(二价)螯合物结合成的共聚物是微弱的，并且大多数蛋白质在洗涤期间被1 摩尔 氯化钠 冲洗掉了.当以钴 (二价)为载体的共聚物,蛋白质的结合力相当强大的和大约48%抑制能力不可能在用200毫摩尔咪唑缓冲(PH值7.0)洗涤后恢复。紧凑的沉淀物本质形成这样的聚合物也许可能导致目标蛋白质的洗涤效率不高。然而，抑制蛋白质从金属螯合共聚物定量地被洗掉了由使用强的螯合剂清除，乙烯二氨酸在100毫摩尔浓度(Sulkowski 1985)。 除非这个蛋白质的利率只关系到唯一的一个聚合物，这个洗涤方法一般情况下不适宜。以镍 (二价) 为载体的共聚物蛋白质的结合力最大限度的被1 摩尔氯化钠洗涤清除掉..或者也许是由于目标蛋白质和某些镍（二价）金属离子弱相互作用或共聚物蛋白质的吸附非特异性的作用。与这些金属离子比较， 铜 (二价)离子显示了最宜的具体结合指数大约89%，可能具体地重新获得96%洗涤结合的蛋白质。观察建议这些以铜(二价)离子的共聚物，可能是一个从未经筛过的麦子粗粉中通过金属螯合亲合力沉淀提取的淀粉酵素抑制剂最理想的系统。我们的结果与在IMAC上观察的结果很符合， 以铜 (二价)-或镍 (二价)为载体的胶凝体被证明是更加成功的(Porath 1992)。 这里被提出的模型系统用于学习目标蛋白质的沉淀行为、结合能力和还原能力用不同的潜在的金属螯合共聚物的。然而我们认为这个系统可以用来学习其他目标蛋白质的推断方法。

蛋白质中的金属螯合共聚物的应用

这种共聚物的沉淀效率高的是用适当浓度的盐在温和的温度下使它们有利于应用在金属螯合亲和沉淀的蛋白质。以铜（二价）为载体的VI和NIPAM的共聚物，我们已成功拟定金属螯合亲和沉淀草案，为净化一些目标蛋白（见表3  。 kunitz型大豆胰抑制蛋白酶（STI） ，是用Cu(II)–poly-VI–NIPAM定量沉淀当使用纯化的时候。从原油中提取的豆粕中，只有46 ％的活性胰蛋白酶是沉淀的，从而表明选择性结合的kunitz STI的类型。文献表明，约40 ％的大豆提取物是抑制活性胰蛋白酶，是由于kunitz型类抑制（ fratalli和施泰纳， 1968年） ，其余的活性是由不同类型的抑制胰蛋白酶促成的。结合和抑制能力可以重新获得原来的92 ％在一个有意义的纯化形式中（ galaev，1997）。当同一抑制胰蛋白酶是用以铜(二价)为载体的–poly-VI–VCL沉淀 ，观察到了抑制较低的沉淀效率。这主要是因为乙烯基己内酰胺共聚物的不完全沉淀。

最近，我们已能纯化一个家族中的单个小麦粉抑制淀粉酶。以铜(二价)为载体的poly-VI-NIPAM沉淀约91 ％的抑制活性淀粉酶，以及蛋白质抑制能力的89%是从聚合物中重新获得,大约净化后的4折，以铜(二价)为载体的聚合物共轭抑制力和结合度是取决于铜(二价)在共聚物和蛋白质中的浓度。在最高负荷1140个单位，约75个单位的抑制剂，可以结合住1毫克的以铜为载体的linked 聚合物，得出了抑制蛋白82%的沉淀效率。通过降低一半左右含量的蛋白质，沉淀效率提高到最高的91 % 。这样一个系统的明显优势是回收聚合物，可重复使用多次而不损的聚合物的功用。以铜(二价)离子为载体的poly-VI-NIPAM的亲和沉淀能力中在第一次使用的抑制淀粉酶仍有50 ％的沉淀效率最多有三个循环的重复利用。重复使用的聚合物不影响从聚合物中得来的蛋白质的还原能力（图5）。减低沉淀效率后，每个周期重复利用解释了一个事实，即在聚合物在每一个循环洗涤过程中某些金属离子被清洗掉了。不过，聚合物与铜(二价)电荷导致更高的沉淀效率在每次重复利用后出现（图6）。现在，在第三循环的聚合物中。有78 %的抑制淀粉酶活性仍可析出，这可看出总体的沉淀效率在85 %以上。在另一个例子中，以铜 (二价)离子为载体的poly-VI-NIPAM被成功地用于从鸭脚稗的种子中（印度手指谷子，Eleusine coracana）提取和分离两种抑制淀粉酶（I-1和I-2）。抑制剂I- 1，2分别为抑制淀粉酶和胰蛋白酶，包括残留在表面上的蛋白质。这些残余物，提供有关团体的金属结合，从而可以结合铜(二价)螯合共聚物。抑制效率在纯化的量是84%的量13倍。另一方面，关于淀粉酶抑制剂I-2，这是毫无这类残留在表面的。抑制剂分离与收益率约85% 。SDS-PAGE的纯化的蛋白质有显着的纯化抑制剂I-1和表现出明确区分这两种蛋白（图7）。这种单步分离方法提供了显着的优势超过了多重层离法净化方法用来净化这两种蛋白（shivraj和pattabiraman ，1981）。

蛋白质的结合能力主要表现出金属螯合共聚物对ph值的强烈依赖。最佳结合力的，是在ph值范围为6.0 - 7.0 。据了解，在这ph值范围内，咪唑组氨酸在组织细胞中的残留量不受保护从而要与金属离子协调好。在所有这些情况下，沉淀是由盐和回收沉淀蛋白是通过解散蛋白聚合物复合咪唑缓冲液（配位体交换洗涤条件） ，以及随后沉淀的聚合物。使用1摩尔氯化钠（高于最适浓度） ，降低沉淀聚合物的温度。

图7 。SDS-PAGE（ 15 ％凝胶浓度）扫描淀粉酶抑制剂。用M标志蛋白;用1 标志粗蛋白提取物鸭脚稗种子;用2标志，淀粉酶抑制剂的提取物后，硫酸铵沉淀及热处理;用3标志洗脱从聚合物沉淀洗涤出来的纯蛋白;用4标志，聚合物沉淀后的上清液（松散性蛋白）。

并能够完全实现在室温下沉淀。由于采用了高浓度的盐聚合物沉淀，在有吸引力的情况下固定金属亲和沉淀。盐的高浓度不干扰蛋白质与金属离子螯合的作用(Porath and Olin, 1983) ，并当有后来的沉淀物的时候可减少非特异性结合的污染蛋白聚合物。(Kumar and Gupta, 1996）。在设计蛋白质提纯方案中，金属螯合的相互作用构成了一个潜在的非常有吸引力的运作模式。非特异性相互作用的亲和力比常规使用的亲和力迟钝。在做亲和沉淀的时候这其实是特别重要的，因为它使更繁琐的处理与对比用色谱程序中，沉淀出不相干的蛋白质。水溶性聚合物有利于形成多点影响，在配合基与弱结合单体形状结合的基础上，从而提高了该系统分离的能力。